庫(kù)蚊通用探針法熒光定量PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)規(guī)則：

1、要保證移液槍的準(zhǔn)確性，誤差不能超過2%?？捎盟碗娮犹炱竭M(jìn)行確定。但有專業(yè)人員進(jìn)行矯正。

2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)。

3、要在實(shí)驗(yàn)前1小時(shí)將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復(fù)到室溫，以使結(jié)果更穩(wěn)定。

4、實(shí)驗(yàn)時(shí)，要使底物避光保存。

5、用槍吸取液體時(shí)速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準(zhǔn)確。

6、吸取液體時(shí)，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。

7、將液體加到酶標(biāo)孔中時(shí)，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會(huì)自然流下去。

8、液體全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動(dòng)30秒，混勻液體。也可以用酶標(biāo)儀的晃動(dòng)功能。

9、應(yīng)盡量做雙孔實(shí)驗(yàn)，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

10、對(duì)結(jié)果有疑問的樣品要用其它方法進(jìn)行確證。為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)人員需嚴(yán)格遵守以下補(bǔ)充操作規(guī)范：

11. 反應(yīng)體系配制應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成，避免氣溶膠污染。所有離心管需預(yù)先標(biāo)號(hào)，并按試劑盒說(shuō)明書精確配制預(yù)混液，使用前需瞬時(shí)離心去除管壁液滴。

12. 加樣順序應(yīng)遵循"由低濃度到高濃度"原則，每加完一組標(biāo)準(zhǔn)品需更換新手套。建議在96孔板邊緣設(shè)置陰性對(duì)照孔（加入無(wú)核酸酶水）和陽(yáng)性對(duì)照孔（試劑盒提供標(biāo)準(zhǔn)品）。

13. 熱循環(huán)儀需提前預(yù)熱至工作溫度，反應(yīng)板裝載時(shí)應(yīng)確保密封膜覆蓋孔口。建議使用離心機(jī)對(duì)反應(yīng)板進(jìn)行2000rpm/10秒離心，消除反應(yīng)體系中的微小氣泡。

14. 數(shù)據(jù)分析階段需設(shè)置合理的閾值線，Ct值＞35的樣本應(yīng)視為可疑數(shù)據(jù)。當(dāng)復(fù)孔Ct值差異＞1.5時(shí)，需重新提取核酸進(jìn)行復(fù)測(cè)。所有原始數(shù)據(jù)應(yīng)保存為儀器導(dǎo)出格式和Excel雙備份。

15. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需立即對(duì)工作臺(tái)面進(jìn)行紫外消毒，廢棄槍頭應(yīng)浸泡于10%次氯酸鈉溶液30分鐘。未用完的試劑應(yīng)按說(shuō)明書要求分裝凍存，避免反復(fù)凍融。

特別提示：當(dāng)檢測(cè)環(huán)境溫度超過28℃時(shí)，建議在加樣區(qū)放置冰盒保持試劑低溫狀態(tài)。對(duì)于臨界值樣本（Ct值32-35），建議采用巢式PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證，并將檢測(cè)結(jié)果與臨床癥狀相結(jié)合進(jìn)行綜合判斷。實(shí)驗(yàn)記錄應(yīng)詳細(xì)記載每批次試劑的貨號(hào)及有效期，以便溯源核查。